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當前位置:南京信帆生物技術有限公司>產品中心>免疫組化實驗代做 > 免疫組化技術服務，免疫組化實驗代測
點擊次數：1444 發布時間：2016/3/18 10:00:02
南京信帆生物服務宗旨：誠信為本；客戶至上；歡迎廣大老師和學生，前來咨詢！
免疫組化主要步驟:
1.洗載玻片: 將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數的組織帶負電荷，從而產生吸附作用。
2.包埋組織: 先在鐵模具中加入一些液態石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，*后加入少許液體石蠟，進行冷凍，使石蠟變成固態。
3.切片：將包埋好的組織從模具上取下來，并置于石蠟切片機上，切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向一致，然后調節切片的厚度，一般為5µm,如果比較難切，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4.撈組織：當組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時候方向一致，以便觀察，再將撈出來的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5.脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.
6.抗原修復：脫蠟后在清水中沖洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內源性的過氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
7.血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來，然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8.加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。
9.加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
10.加SABC: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11.加顯色劑: 將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻） A：DAB B：H2O2 C：磷酸緩沖液
12.復染: 將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13.脫水：將復染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min，*后浸泡在二甲苯中，搬到通風柜中。
14.封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側，然后輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好片子后置于通風柜中晾干。
免疫組化的相關試劑：*重要的是選擇好一抗、二抗或者還有三抗，注意抗體的特異性、效價和交叉反應。
其他常用試劑有：
1、0.01M(pH7.4)的磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），稀釋抗體和洗片子用；
2、清潔液、純水，洗玻片用
3、多聚賴氨酸處理載玻片，防止脫片
4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等；
5、15%~30%蔗糖，組織脫水用；
6、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，或者OCT包埋做冰凍切片；
7、抗原修復液：枸櫞酸緩沖液（pH6.0）；
8、活化劑：EDTA或者Triton X-100；
9、1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封閉液；
10、H2O2，滅活內源性過氧化物酶；
11、顯色液：根據你做的酶來選擇，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫熒光則不需要；
12、50%緩沖甘油封片液。
更新時間：2024/1/3 11:50:22
