制備基因組 DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續的實驗打下基礎。一般真核細胞基因組DNA有107-9 bp，可以從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現的。這一方法獲得的DNA不僅經酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構建等實驗。??? 根據材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下兩個原則：（1）防止和抑制DNase對DNA的降解；（2）盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞。 一、試劑準備 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。3．裂解緩沖液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100 m g/ml。 4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris飽和酚（pH 8.0）、酚/（酚∶=1∶1）、7．無水乙醇、75%乙醇 二、操作步驟 （一） 材料處理 1．新鮮或冰凍組織處理： ⑴ 取組織塊0.3-0.5cm3 , 剪碎，加TE 0.5ml，轉移到勻漿器中勻漿。 ⑵ 將勻漿液轉移到1.5ml離心管中。 ⑶ 加20% SDS 25 m l，蛋白酶K (2mg/ml) 25 m l，混勻。 ⑷ 60 ° C水浴1-3hr。 2．培養細胞處理： ⑴ 將培養細胞懸浮后，用TBS洗滌一次。 ⑵ 離心4000g×5min，去除上清液。 ⑶ 加10倍體積的裂解緩沖液。 ⑷ 50-55 ° C水浴1-2hr。 （二）DNA提取 1. 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。2. 離心5000g×10min，取上層水相到另一1.5ml離心管中。 3. 加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。4. 加等體積酚/，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重復此步驟數次。5. 加等體積，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。6. 加1/10體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。 7. 待絮狀物出現后，離心5000g×5min，棄上清液。8. 沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min ，棄上清液。9. 室溫下揮發乙醇，待沉淀將近透明后加50-100 m l TE溶解過夜。(三）DNA定量和電泳檢測 1. DNA定量： ??? DNA在260nm處有的吸收峰，蛋白質在280nm處有的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進行分光測定DNA濃度，OD值為1相當于大約50μg/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用 H2 O稀釋DNA樣品n倍并以H2 O為空白對照，根據此時讀出的OD260 值即可計算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260 讀數×稀釋倍數/1000。 ??? DNA純品的OD260 /OD280 為1.8，故根據OD260 /OD280 的值可以估計DNA的純度。若比值較高說明含有RNA，比值較低說明有殘余蛋白質存在。OD230 /OD260 的比值應在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽存在。 2. 電泳檢測： ?? 取1μg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測DNA的完整性，或多個樣品的濃度是否相同。電泳結束后在點樣孔附近應有單一的高分子量條帶。三、 注意事項 1. 所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。2. 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。3. 用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。4. 用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實驗（如Southern 雜交、PCR等）目的。如要求更高，可參考有關資料進行DNA純化。
www.app17.comelisa試劑盒，進口elisa試劑盒，elisa kit，進口血清，進口試劑，明膠酶譜法檢測試劑盒，大鼠elisa檢測試劑盒，人elisa檢測試劑盒-南京信帆生物技術有限公司
原創作者：南京信帆生物技術有限公司
