基質金屬蛋白酶(MMP2/9)試劑盒,明膠酶譜法試劑盒

本產品僅供科研實驗，不得用于醫療或食用。 基質金屬蛋白酶(mmp-2/9)試劑盒/明膠酶譜法試劑盒

描述：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與胚胎發育、形態發生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與組織中的 MMP-2、MMP-9 參與各種生理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視 1。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達 1 nM，高于 ELISA 方法 2，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結束后取出凝膠與酶反應 Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區域，從而能同時指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供

MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩沖液，可檢測少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1 nM。試劑盒可進行 50 次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為 10~15

個，則總計可檢測 500~750 個樣品。

適用: 檢測 MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。 組成與儲存 (50 assays)：

2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, ?20 ºC；
10 × Substrate G, 50 ml, ?20 ºC；

3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液(#P1501), 4 ºC。

檢測步驟：

1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%。按照標準程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，并 90 ºC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。

2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染 Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體積混合，取 5-15µl 上樣。

3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為 20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入 10 ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。

5. 孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時。陽性對照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低，應延長孵育時間為 10 小時或過一夜。

6. 顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區域被深染，在有 MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。透明區域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現透明條帶。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中*常見的格式。

說明

1. 10 mM 能夠 EDTA 完全抑制 MMP 活性。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠，作為永久記錄保留。

參考文獻：

Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
Heussen C, and Dowdle EB.Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202