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閱讀次數:4863 發布時間:2023/12/20 15:29:35
脫氫抗壞血酸(DHA)檢測試劑盒(菲咯啉微板法)的操作步驟
產品簡介:
維生素 C(Vitamin C)又稱 L-抗壞血酸(AsA),是高等靈長類動物與其他少數生物的必需營養素,在生物體內維生素 C 是一種抗氧化劑,為酸性己糖衍生物,是稀醇式己糖酸內酯,保護身體免于自由基的威脅,同時也是一種輔酶,其廣泛的食物來源為各類新鮮蔬果。Vc有 L-型和 D-型兩種異構體,只有 L-型的才具有生理功能,還原型和氧化型都有生理活性。
脫氫抗壞血酸(DHA)檢測試劑盒(菲咯啉微板法)檢測原理是利用還原劑將脫氫抗壞血酸還原成還原型抗壞血酸,在酸性條件下維生素 C(抗壞血酸)把三價鐵離子還原成亞鐵離子,后者與菲咯啉形成穩定的紅色螯合物,以酶標儀 534nm 處檢測吸光度,在一定濃度范圍(樣品濃度控制在 10~250μg/ml)吸光度與抗壞血酸含量呈線性關系,獲得抗壞血酸含量。該試劑盒主要用于植物組織中的維生素 C(抗壞血酸)的檢測,計算出總抗壞血酸含量,從中減去樣品中原有的還原型抗壞血酸含量,即得脫氫抗壞血酸含量。優點是:1、反應穩定,不易褪色;2、操作簡便;3、還原糖及其他常見的還原物質對實驗沒有干擾,因此專一性好;4、靈敏度高。本試劑盒僅用于科研領域,不宜用于臨床診斷或其他用途。
操作步驟(僅供參考):
1、稀釋組織勻漿液:按組織勻漿液(5×):蒸餾水=1:4 的比例稀釋,獲得 1×組織勻漿液,待用。
2、制備 AsA 提取液:取待測材料如青菜、水果、松針等,清洗擦干,準確稱量 2.5g,加入研磨器內,再加入少量 1×組織勻漿液,研磨碎,留取上清,再次用 1×組織勻漿液研磨,一并倒入 50ml 離心管,補充 1×組織勻漿液至 22.5ml,充分混勻,4000g 離心 5min,留取上清液即為 AsA 提取液。
3、制備 DHA 待測液:取 4ml AsA 提取液,加入 2ml DHA 還原液,用 NaOH 溶液調節pH 至 7~8,室溫下靜置 10min,使脫氫抗壞血酸還原成抗壞血酸,再加入 1.6ml 組織勻漿液(5×)和 0.4ml 蒸餾水即為 DHA 待測液。
4、配制系列抗壞血酸標準:取干凈的 96 孔板,按下表進行操作,依次稀釋。
5、DHA 加樣:按照下表設置空白孔、標準孔、AsA 測定孔、DHA 測定孔,溶液應按照順序依次加入,并注意避免產生氣泡。如果樣品中的抗壞血酸含量過高,可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定,樣品的檢測能設置 2 平行孔,求平均值。
6、DHA 測定:立即混勻,以空白調零,酶標儀測定 534nm 處系列標準孔、AsA 測定孔、DHA 測定孔的吸光度。
計算:以系列標準抗壞血酸(5、10、20、30、40、50μg)為橫坐標,以對應的吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,求得回歸方程。以 AsA 測定孔吸光度代入回歸方程求得 AsA 提取液中 AsA 含量;以 DHA 測定孔吸光度代入回歸方程求得 DHA 待測液中總 AsA 含量;總 AsA 含量與 AsA 提取液中 AsA 含量的差值即為脫氫抗壞血酸(DHA)含量。
DHA 含量(mg/100g)=(m0×VT×100)/(m1×VS×1000)
式中:m0=總 AsA 含量與 AsA 提取液中 AsA 含量的差值(μg)
VT=待測液的總體積(ml)
m1=樣品質量(g)
VS=測定時取樣體積(ml)
100=100g
注意事項:
1、 上述低溫試劑避免反復凍融,以免失效或效率下降。
2、 組織勻漿液(5×)久置或低溫保存,容易產生乳白色渾濁;如果白色渾濁不明顯,可以直
接使用,不影響效果;如果白色渾濁較多,應棄用。
3、 待測樣品如不能及時測定,應置于 2~8℃保存,3 天內穩定。
4、 如果樣品濃度過高,應用蒸餾水稀釋后重測,結果乘以稀釋倍數。
有效期: 6 個月有效。4℃運輸,4℃保存。
脫氫抗壞血酸(DHA)檢測試劑盒(菲咯啉微板法)的操作步驟
原創作者:南京信帆生物技術有限公司