信帆生物科普：ELISA 標準操作及技術服務的常見問題
ELISA 標準操作要點
優質的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化水電導率小于 1.5μs/cm。
1. 標本的采取和保存
大部分 ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以 HRP 為標記的 ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性 HRP，也會產生假陽性反應。一般說來，在 5 天內測定的血清標本可放置于 4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清 IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡?；鞚?/span>或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
2.加樣
加樣時應將所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。
3.保溫
在建立 ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在 37℃經1-2 小時，產物的生成可達頂峰。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。
4.洗滌
洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？?/span>以說在 ELISA 操作中，洗滌是*主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格
按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫 20，其濃度可在 0.05%-0.2%之間，高于 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗
的靈敏度。 洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率在 1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為 40 秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。
5. 顯色和比色
TMB 經 HRP 作用后，約 40 分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至 2 小時后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24 小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。
酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀 ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到 0.001，準確性為±1%，重復性達 0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在 15~30℃，使用前先預熱儀器 15-30 分鐘，測讀結果更穩定。
測讀 A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，次在*適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不 移動 ELISA 板的位置，*終測得的 A 值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
