脯氨酸(PRO)檢測試劑盒(茚三酮微板法)的用途

閱讀次數：333 發布時間：2023/12/20 15:26:46

脯氨酸(PRO)檢測試劑盒(茚三酮微板法)的用途

產品簡介：

脯氨酸(Proline，Pro)是一種環狀的α-亞氨基酸，呈中性，等電點為 6.30，水中溶解度比任何氨基酸都大，25℃時 100g 水中可溶 162g 左右，易潮解不易得結晶，有甜味。脯氨酸與茚三酮溶液共熱，生成黃色化合物，一旦進入肽鏈后，可發生羥基化作用，從而形 4-羥脯氨酸，是組成動物膠原蛋白的重要成分，羥脯氨酸也存在于多種植物蛋白質中，尤其與細胞壁的形成有關，在正常情況下脯氨酸含量較低，但在逆境下(旱、熱、冷、凍、鹽堿等)，常有脯氨酸的明顯積累，即積累指數與植物的抗逆性有關，在臨床、生物材料、工業等方面均有廣泛應用。脯氨酸(PRO)檢測試劑盒(茚三酮微板法)檢測原理是脯氨酸游離于磺基水楊酸溶液中，前者與酸性茚三酮共熱發生反應，產生穩定的紅色產物，以酶標儀測定 520nm處吸光度值，在一定濃度范圍內顏色深淺與脯氨酸濃度成正比。該試劑盒主要用于測定植物組織中的游離脯氨酸含量，僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

1、配制 PRO Lysis buffer(1×)：取 1 份 PRO Lysisbuffer(5×)加 4 份去離子水混勻即成。

2、配制茚三酮顯色液: 準確稱取 0.75g 茚三酮，溶解于 30ml 茚三酮稀釋液中，70℃加熱攪拌至完全溶解(也可用超聲助溶)，混勻，即為茚三酮顯色液。4℃避光備用，48h 有效。

注意：茚三酮稀釋液具有一定腐蝕性，請小心操作。如果 2 天內用不完，可以稱取一定量的茚三酮，加入茚三酮稀釋液使終濃度為 2.5%即可。

3、準備樣品：

①植物樣品：取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，切碎，迅速稱取 0.5g，加入 5ml PROLysis buffer(1×)后勻漿或研磨，沸水浴 10min(期間經常搖動)，混勻，用濾紙或紗布過濾，濾液即為脯氨酸提取液，4℃保存備用。

②血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，-20℃凍存，用于脯氨酸的檢測。

③細胞或組織樣品：取恰當細胞或組織裂解液，如有必要用 PRO Lysis buffer(1×)進行適當勻漿，留取上清即脯氨酸提取液，用于脯氨酸的檢測。4℃保存備用，3 天有效。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高濃度的脯氨酸，可以使用 PRO Lysis buffer(1×)進行恰當的稀釋。

4、配制系列脯氨酸標準溶液：取出脯氨酸標準(100μg/ml)恢復至室溫后，用去離子水稀釋為脯氨酸標準(10μg/ml)。

5、PRO 加樣：按照下表設置空白管、標準管、測定管，溶液應按照順序依次加入，并注意避免產生氣泡。如果樣品中的脯氨酸濃度過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定，樣品的檢測能設置平行管。

6、PRO 測定：迅速冷卻加入 0.6~0.9ml 甲苯或二甲苯，振搖 30s，靜置片刻，取上清液轉移至新的離心管或試管，3000r/min 離心 10min，取上清液 200μl 分別加至 96 孔板中，空白管調零，520nm 處用酶標儀測定標準管和測定管吸光度。注：加入甲苯或二甲苯的量前后應統一；空白管和標準管不用離心，可直接取上清液測定。

計算：以系列脯氨酸標準(1~7 號)濃度(μg/ml)為橫坐標，以對應的吸光度為縱坐標，制作標準曲線，根據測定管的吸光度進而計算其脯氨酸濃度。根據如下公式計算具體樣品中脯氨酸的含量：

植物組織樣品 PRO(μg/g)=C×VT/W

式中：C=從標準曲線上查得的脯氨酸濃度(μg/ml)

VT=脯氨酸提取液總體積(ml)

W=樣品鮮重(g)

血清、尿液等樣品 PRO (μg/ml)=C×N

式中：C=從標準曲線上查得的脯氨酸濃度(μg/ml)

N=稀釋倍數

注意事項：

1、實驗材料應盡量新鮮，如取材后不立即使用，應存于 4℃。

2、 PRO Assay buffer 應密閉保存，防止揮發。

3、 PRO Lysis buffer(5×)、PRO Assay buffer 和茚三酮稀釋液都有一定腐蝕性，應小心操作。