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當前位置:南京信帆生物技術有限公司>產品中心>Western blot實驗代做 > WB實驗代測
點擊次數：740 發布時間：2017/3/20 9:59:33
與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。
經過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
western blot一般步驟：蛋白質抽提，蛋白質定量，變性聚丙稀酰胺不連續凝膠電泳（SDS-PAGE），蛋白質轉移，western blot膜的封閉和抗體孵育，western blot結果檢測，western blot數據分析，提供實驗報告。
western blot服務內容：專業的隊伍，提供完整的實驗步驟和結果，提供專業的數據分析，提供電子版掃膜結果，以及灰度值分析。
Western blot樣本要求
客戶需新鮮或正確保存的蛋白樣品， 檢測目的蛋白的一抗（或由本公司代購）。樣品要求為：
1、裂解樣品總蛋白量>500ug/樣品。
2、細胞樣品總蛋白濃度>1mg/ml。
3、組織樣品總蛋白濃度>10-15mg/ml。
Western blot結果及數據提供
內參蛋白和目的蛋白曝光膠片各一張，可提供掃描圖，實驗報告，包括整個試驗流程所涉及的實驗數據和實驗步驟。如需進行蛋白純化服務，將提供檢測報告
WB實驗代測
服務內容
我們提供從蛋白制備、蛋白電泳到Western blot檢測的全流程服務，如需要還可進行灰度分析。
說明
1、建議提供目的蛋白陽性表達樣品（純蛋白或有陽性表達的細胞或組織）作為陽性對照。
2、每張膜檢測1-8個樣品。
3、如果一抗由客戶提供，請在正確條件下保存，避免污染及反復凍融。
關于Western blot實驗異常分析
『無信號』
| 原因 | 建議 |
| 一抗與二抗不匹配 | 選擇針對一抗來源種屬制備的二抗； |
| 一抗不識別目的的種屬的蛋白 | 1)檢查抗體的說明書，適用范圍內是否包含目的種屬 |
| 一抗或二抗不足，沒有足夠的抗體結合到目的蛋白 | 1)降低抗體稀釋倍數，增加抗體濃度 |
| 封閉劑與一抗有交叉反應 | 改變封閉劑 |
| 抗原不足 | 1)每個泳道加入20-30ug總蛋白 |
| 在檢測的組織內目的蛋白表達水平低 | 檢測樣本不表達目的蛋白選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性，也可更換細胞系 |
| 蛋白轉膜效率低 | 1)利用麗春紅檢測轉膜效率;檢查轉移裝置是否電極弄反 |
| 膜過渡洗滌 | 減少洗滌時間和強度 |
| 疊氮鈉抑制二抗活性 | 二抗稀釋液內不用疊氮鈉 |
『沒有特異條帶』
| 原因 | 建議 |
| 細胞系傳代過多后蛋白表達譜發送變化 | 1)使用未傳代或傳代次數較少的細胞系進行樣品制備 |
| 蛋白本身有很多修飾 | 1)查閱文獻，確定目的蛋白是否存在多種修飾 |
| 蛋白被消化或者降解 | 1)蛋白樣品確保未被污染，確保含有蛋白酶抑制劑 |
| 所檢測蛋白存在多種剪接體，導致分子量大小不同 | 1)查閱文獻或者通過搜索數據庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA |
| 一抗或二抗濃度高 | 1)減低抗體濃度 |
| 洗滌不夠 | 1)充分洗滌 |
『條帶大小不正確』
| 原因 | 建議 |
| 目的蛋白被降解 | 確保蛋白樣品未被污染，確保含有蛋白酶抑制劑 |
| 存在不同的剪接體 | 查閱文獻或者通過搜索數據庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA |
| 重組蛋白 | 檢測是否存在額外加入的蛋白 |
| 特殊蛋白如MDM2等 | 仔細閱讀抗體說明書 |
尊敬的客戶：
本公司有放射免疫技術服務、蛋白質組學服務、免疫組化、PCR技術服務、生物信息學數據分析等，如果您想了解Western blot的更多內容或者其他服務信息，您可以撥打本公司的服務熱線了解更多產品的詳細信息，至善至美的服務是我們永無止境的追求，歡迎新老客戶放心選購自己心儀產品，我們將竭誠為您服務！
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更新時間：2024/1/3 11:50:32
